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細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)具體操作說明
點(diǎn)擊次數(shù):380 更新時(shí)間:2024-05-27

        細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過程,分為間期與分裂期兩個(gè)階段。如下圖:


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G0期:這一期的細(xì)胞稱為休眠細(xì)胞,細(xì)胞暫時(shí)脫離分裂周期,不進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂。但這些細(xì)胞可在某些條件的誘導(dǎo)下可重新開始DNA合成, 進(jìn)行細(xì)胞分裂。

G1 期:主要合成RNA、核糖體、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物。

S期:這個(gè)時(shí)期主要合成DNA, 同時(shí)還會(huì)合成組蛋白, DNA復(fù)制所需的酶都在這一時(shí)期合成。

G2期:DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白質(zhì), 包括微絲微管蛋白。

M期:RNA合成停止, 蛋白質(zhì)合成減少, 染色體高度螺旋化。

細(xì)胞周期檢測的原理:

PI法是經(jīng)典的周期檢測方法,PI是碘化丙啶(Propidium),一種雙鏈DNA的熒光染料,碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可產(chǎn)生熒光,并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后,可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測定,然后根據(jù)DNA含量的分布情況,可進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。

通常正常細(xì)胞的G0/ G1 期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N),G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于2N和4N之間。細(xì)胞用冰乙醇固定通透后,PI可以與細(xì)胞的DNA結(jié)合,其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。

因此,可以通過流式細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測,將細(xì)胞周期區(qū)分為G1/G0 期,S 期和G2/M 期,并可得出各個(gè)時(shí)期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)流程:

收集細(xì)胞:A: 收集細(xì)胞5~20×105于離心管中,若細(xì)胞比較小(如淋巴細(xì)胞)400 g離心,若細(xì)胞比較大(如腫瘤細(xì)胞)300 g離心,5~10 min,棄去培養(yǎng)液;

洗滌:加入1 ml冷PBS(提前放4℃預(yù)冷)洗滌1次,離心棄去上清;

固定前處理:利用管底殘留的液體,輕彈管底,將沉淀重懸成細(xì)胞懸液,避免細(xì)胞成團(tuán);

細(xì)胞固定:加入約1 ml -20℃預(yù)冷的無水乙醇中,輕輕吹打混勻,-20℃固定1 h或過夜;

洗滌:加入1 ml冷PBS(提前放4℃預(yù)冷)洗滌1次,300 g離心10min,棄去上清;

RNA酶消化:300 g 離心 5 min,吸盡上清后,加入 100 μL 的 RNase A 并充分懸浮細(xì)胞,37°C 水浴 30 min。

PI染色:加入400μL的PI溶液并充分混勻,4℃避光孵育30 min;

上機(jī)檢測:用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光,低速獲取細(xì)胞,采用分析軟件進(jìn)行DNA含量分析。

細(xì)胞周期檢測注意事項(xiàng):

1、培養(yǎng)細(xì)胞注意無菌環(huán)境。

2、染液等物質(zhì)有一定毒性,注意防護(hù)。

3、本實(shí)驗(yàn)上機(jī)檢測所需收集細(xì)胞量較多,收集細(xì)胞時(shí)盡量多收集一些。

4、本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞離心,重懸次數(shù)較多,注意動(dòng)作輕緩,避免過多地?fù)p傷細(xì)胞。

5、固定時(shí)必須預(yù)冷PBS重懸打入無水乙醇中,二者順序不可顛倒。

6、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),以對(duì)數(shù)期處理為宜,避免細(xì)胞量過少導(dǎo)致收集細(xì)胞量不足或者細(xì)胞量過多導(dǎo)致細(xì)胞開始大量死亡造成的實(shí)驗(yàn)誤差。

7、固定后細(xì)胞雖然可以保存較長時(shí)間后再上機(jī)檢測,為避免不可控因素影響最好及早上機(jī)檢測。


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